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    引物修饰的常见类型及应用

    修饰类型 修饰名称 特点及应用
    反义DNA合成 硫代 硫代修饰(Phosphorthioate)的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代,但随着硫代碱基的增加,寡核苷酸的Tm值会降低,为了降低这种这种影响,可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰,通常可以选择5'3'3个碱基进行硫代修饰。
    2氟代核糖核酸 AG因为其比较复杂的化学结构而难于合成,一般常用的2氟代的有CU.
    2'-O-甲基核糖核酸 RNA的修饰中, 2'-O-甲基核糖核酸(2'-O-甲基-RNA)修饰普遍存在于tRNA 和其他转录后调控的小RNA中,含有2'-O-甲基核糖核酸寡核苷酸片段可以被直接合成,这个修饰可以增加RNARNA duplexesTm值,但是对于RNA:DNA的稳定性将会有微小的改变,如果期待以单链核酸的形式被进攻,他是稳定的,并且是典型的5-10个折叠,比DNA更不易与DNases相结合,作为能够稳定增加与目标信息结合能力的有效工具,2'-O-甲基核糖核酸修饰被普遍应用于反义寡核苷酸。
    5-甲基脱氧胞嘧啶 每个脱氧胞嘧啶被5-甲基脱氧胞嘧啶(5-Methyl Dc)取代后其熔点温度将会增加0.5℃,另外当寡核苷酸片段植入活体内引发一些不必要的免疫反应,5-甲基脱氧胞嘧啶在CpG 修饰中的出现将会阻止或限制这些反应,这一点在反义核酸应用中是非常重要的一方面。
    碱基修饰 脱氧次黄嘌呤 脱氧次黄嘌呤(deoxyInosinedI)是一个自然存在的碱基,虽然不是真正意义上的必威碱基,但当与其它碱基结合时,会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT。在DNA聚合酶的催化下,脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。
    脱氧脲嘧啶 脱氧脲嘧啶(DeoxyUridinedU)可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7℃。
    2-氨基嘌呤 2-氨基嘌呤(2-Aminopurine)在寡核苷酸中可以替代 dA,它是一种常见的荧光分子,对于周围环境较敏感, 可作为一种有效的探针用于监测DNA的发卡结构的构成和动态变化,还可以检测双螺旋碱基的堆积状态,2-氨基嘌呤会不确定地轻微地降低Tm值。
    5--脱氧尿嘧啶 5-- 脱氧尿嘧啶(5-Bromo dU) 是一种光敏的卤代碱基,在有紫外线照射的情况下,它可被掺入寡核苷酸里与DNARNA 或蛋白交联,在308 nm处时,交联效率最大。
    反向dT 反向dT (Inverted dT)可以被合成在寡核苷酸的-末端,从而形成交联,形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。
    双脱氧胞苷 双脱氧胞苷(3'ddC Dideoxy-C)是连接在末端阻止DNA聚合酶在端的延伸。
    间臂 间臂(Spacer)可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用,主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer 主要用于模仿核糖的和羟基间的三碳间隔,或“替代”一个序列中未知的碱基。-Spacer C3用于引进一个间臂从而阻止端外切酶和端聚合酶发挥作用。 Spacer 18 常用于引进一个强疏水基团。
    氨基修饰 内部氨基修饰 主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离,可用于进一步的标记和酶连接(如碱性磷酸酶),目前提供内部氨基修饰介导的dT-DabcyldT-BiotindT-Digoxingenin 修饰。
    5'氨基修饰 可用于制备功能化的寡核苷酸,广泛应用在DNA芯片(DNA Microarray)和多重标记诊断系统。目前提供5 C6 氨基修饰和5C12氨基修饰两种,前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物,后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记,尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
    3'氨基修饰 目前提供C6 氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸,例如5’端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外,修饰可以抑制外切酶酶解,从而可用于反义实验。
    巯基修饰 5’-巯基(Thiol)在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5’的巯基修饰主要用5’巯基修饰单体(5’-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite)。用5-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基(trityl),而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。
    磷酸化 5’磷酸化(Phosphorylation)可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。磷酸化可抗外切酶消化的相关实验中,也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。
    地高辛 地高辛(Digoxigenin)是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质,因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源,所以抗地高辛抗体不会结合到其他生物物质。地高辛经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置。杂交的地高辛探针可以由抗地高辛抗体来检测,这个抗体一般会与碱性磷酸酶,过氧化物酶,荧光素或胶体金偶连。或者没有偶连的抗地高辛抗体但偶连的抗体。地高辛标记的探针可用于各种杂交反应,如DNA-DNA杂交(Southern blotting)DNA-RNA杂交(Northern blotting)斑点杂交(Dot blotting ),克隆杂交,原位杂交以及酶联免疫分析(ELISA)
    生物素 生物素(Biotin)修饰的寡核苷酸能紧紧的结合在链霉亲和素蛋白上,链霉亲和素蛋白可以标记上荧光染料和酶或是附着的中间结合物附着在固体物生物表面,不同的分子生物学和纯化方法都包含生物素修饰。生物素修饰可以利用C6或是TEG间臂被添加在寡核苷酸的5 末端,生物素TEG需要纯化,中间的生物素修饰可以通过dT碱基加入,这种形式需要更多的纯化步骤。引物生物素标记,可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。

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