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      引物合成的原理

             目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。基于该方法的DNA合成仪有多种,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。必威体育网app公司采用新一代高通量自动betway必威体育仪技术,充分保证了实验室相关领域的研究及生物产业应用的不同需求。        固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的,合成方向是由3’端开始,相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如下:        第一步,脱保护基(Deblocking),将被固相载体(CPG,树脂等)上保护的活性基团与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;        第二步,活化(Activation),将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱,形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化,但5'-端仍受DMT保护),此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应;        第三步,连接(Coupling),亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时,将与其5'-羟基发生亲合反应,缩合并脱去四唑,此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基;        第四步,带帽(Capping),缩合反应后,为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸,常通过乙酰化来封闭此端羟基,一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的;        第五步,氧化(Oxidation),缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。        经过以上五个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

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