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甲基化
        DNA甲基化是最早发现的betway表观修饰方式之一,真核betway中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与betway质相互作用方式的改变,从而控制betwaybetway。DNA甲基化通常抑制betwaybetway,去甲基化则诱导了betway的重新活化和betway。这种DNA修饰方在不改变betway序列前提下实现对betwaybetway的调控。CpG位点在betway组是不常见的,主要密集于接近betway启动子的位置,统称为CpG岛CpG岛大约含有500多个碱基,位于betway的启动子区或第一个外显子区。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌betwayCpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致抑癌betwaybetway的下降。

甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)

        Herman 等( 1996 )在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高,主要用于作定性研究。用亚硫酸氢盐处理betway组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的app进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的app能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。
        特点:适用范围广,能够检测特异位点是否发生甲基化。

服务订购

项目类型 检测方法 DNA甲基化分析服务价格

DNA甲基化服务

BSP-10个app

DNA提取和亚硫酸氢盐处理

片段扩增+10app测序

140元/样品

800元/样本/片段

MSP-电泳法

询  价

询  价


流程

1、样品用Qiagen试剂盒进行betway组 DNA 提取与重亚硫酸盐处理(包括纯化和脱磺基反应)。
2、用甲基化app设计相关软件在甲基化区域设计 甲基化特异性的app( primer Ⅰ )或非甲基化的app( primer Ⅱ ) app 2 对。
3、 进行特异性的 PCR 扩增,只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性app的片段才能扩增出产物。
4、检测 MSP 扩增产物,如果用针对处理后甲基化 DNA 链的app能扩增出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化 DNA 链的app扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化。

亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
        亚硫酸氢盐修饰后测序法( BSP ) Frommer 等( 1992 )提出的研究 DNA 甲基化方法,此方法可靠性及精确度高,能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态。
        用亚硫酸氢盐处理betway组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSPapp进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化,称为BSP-直接测序法。将PCR产物app至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-app测序法。
        特点:精确度高,能够准确检测出甲基化的程度百分比。

流程

1、样品用Qiagen试剂盒进行betway组 DNA 提取与亚硫酸盐处理(包括纯化和脱磺基反应),使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。
2、用甲基化app设计相关软件在甲基化区域两端设计app。
3、进行betway扩增及 PCR 产物回收。
4、PCR 产物直接测序或app测序(定量分析),分析每个 CpG 岛甲基化情况 。
5、数据统计分析。与未甲基化的 DNA 样本进行比对。


样品要求


1、DNA样品:浓度≥100ng/ul、体积≥20ul的总DNA样品,DNA抽提:血液20元/样本;新鲜组织30元/样本;石蜡包埋组织50元/样本;
2、血液样品:请提供≥500ul抗凝血;采用标准的采样管, EDTA 抗凝或枸椽酸钠抗凝;
3、组织样品:请提供足量的组织样品(≥300mg);
4、体育网(≥106 );
5、甲基化位点信息:免费提供甲基化岛分析。

提供报告

1、MSP:app序列、实验报告、包括MSP产物的电泳图片;
2、BSP:app序列、测序峰图、阳性appbetway和实验报告;

甲基化研究思路

寻找甲基化位点
1、甲基化二代测序寻找甲基化位点
对照组和实验组进行甲基化芯片检测,找到相关的甲基化位点;
一些相关研究显示某些betway存在betway量降低的现象,可预测该betway是否存在CpG岛;
根据文献寻找相关betway的甲基化位点。
2、验证甲基化位点,并进行甲基化程度分析
采用对照组和实验组样本进行甲基化验证;
MSP方法:可进行特定位点甲基化验证,适用于甲基化芯片后的结果,无法进行甲基化程度分析;
BSPapp测序法:验证某些相关betway的甲基化位点,并计算出精确的甲基化程度百分比;
HRM法:适用于大批量样本甲基化验证,并能计算出甲基化程度范围;
焦磷酸测序法:验证某些相关betway的甲基化位点,并计算出精确的甲基化程度百分比。
3、分析甲基化位点与研究的相关性
根据对照组和实验组样本的检测结果,分析与研究的相关性;
比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异;
比对对照组合实验组相同betway启动子区甲基化程度是否有差异。
4、验证启动子发生甲基化的betway的betway量变化
采用荧光定量PCR的方法检测相关betway的betway量,如果betway量降低,可能由于启动子区发生甲基化导致的,从而影响该betway所在的某些通路,导致一些疾病,或表型发生变化;如果没有发生变化,可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切,从而不会影响betway的betway。
        DNA甲基化是最早发现的betway表观修饰方式之一,真核betway中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与betway质相互作用方式的改变,从而控制betwaybetway。DNA甲基化通常抑制betwaybetway,去甲基化则诱导了betway的重新活化和betway。这种DNA修饰方在不改变betway序列前提下实现对betwaybetway的调控。CpG位点在betway组是不常见的,主要密集于接近betway启动子的位置,统称为CpG岛CpG岛大约含有500多个碱基,位于betway的启动子区或第一个外显子区。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌betwayCpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致抑癌betwaybetway的下降。



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