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        包涵体复性方法



        一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点:活性蛋白质的回收率高;正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品;折叠复性方法易于放大;复性过程耗时较少。(即回收高,易分离,浓度高,易放大,耗时少。)

        1. 透析、稀释和超滤复性法:

              这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法,复性活性回收率低,而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长,易形成无活性蛋白质聚集体;超滤法在膜上聚集变性(不可逆变性),易造成膜污染;稀释法(直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制)处理量太大,不利于工业放大。

        2. 凝胶过滤层析复性

             凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC),是一种广泛应用的层析技术。与常用的稀释复性法相比,凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性,活性回收率较高,同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。 凝胶过滤复性时,除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外,蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。复性过程始终发生在溶液中。蛋白质在伸展状态中,每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别,而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同,有的会扩散入颗粒内部深一些,有的会浅一些,这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离,这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少,从而起到一定抑制凝集的作用;即使发生了部分凝集,凝集的蛋白质会附着在胶粒上,而不随着溶液向下运动,这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质,使其重新溶解并变性;并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢,这对有些蛋白质的复性是有利的。 在普通凝胶过滤中,变性剂和还原剂的脱除(??)虽较稀释复性慢,但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子,接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。此法为蛋白质复性提供了一个较温和的环境,实现了线性去除变性剂,对高浓度变性蛋白质的复性效果十分显著。对初始浓度为17mg/ml的还原变性溶菌酶,在40min内可以得到高达9O%的活性回收率。此外在脲梯度SEC的基础上发展了pH和脲浓度双梯度SEC法用于蛋白复性,效果很好。 在SEC复性的基础上设计的连续基质辅助蛋白复性系统能使变性蛋白定量地转换成复性的天然态蛋白。此复性方法能够将复性过程中产生的蛋白聚集体再次复性,使蛋白最大程度地得到回收。伴侣溶剂塞(Chaperon solvent plug)SEC复性法在一定程度上解决了变性蛋白进入柱顶端之前发生沉淀这一问题。此外,抗体、小分子添加剂如L一精氨酸和环糊精等共价结合到SEC固定相上也可能会提高某些蛋白的复性效率,同时又能使这些物质得以重复利用,降低生产成本。

        3. 高蛋白浓度下的复性方法:

             一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。在两次蛋白加入之间,应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集,直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后,温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行,变性剂浓度应高到足以有效防止聚集,同时又必须低到能够引发正确复性。

        4. 添加促进剂的复性方法:

             包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为:稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有: a) 共溶剂:如PEG6000~20000,通过与中间体特异的形成非聚集的复合物,可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会,减少蛋白质的聚集; b) 去污剂及表面活性剂:如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用,但它们能与蛋白质结合,很难去除; c) 氧化-还原剂:对于含有二硫键的蛋白,复性过程中应加入氧化还原体系,如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等,氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应,提高了正确配对的二硫键的产率; d) 小分子的添加剂:如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等,都可阻止蛋白聚集,它们的作用可能为:稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg:L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定,使折叠向正确方向进行,可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。 e) 添加分子伴侣和折叠酶:分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象,并能通过有控制的结合和释放,促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠,提高蛋白质的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去,而且十分昂贵,因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。 f) 人工伴侣(new):为模仿分子伴侣而发展的一种方法:首先,变性蛋白被复性液中的去污剂捕获,形成蛋白-去污剂复合体,复合体的形成抑制了蛋白的聚集,然后加入环糊精从复合体中去除去污剂,使得蛋白质正确折叠。 g) 单克隆抗体(new):待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性,但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。 h) 其它:多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性,具有稳定天然蛋白质的作用;甘油可以增加黏度,减少分子碰撞的机会,减少错配以提高复性效率;适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力,有利于蛋白质的折叠;辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成,对蛋白有稳定的作用。

        5. 液相色谱(LC)复性法:

        液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法,已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手段,现有报道,疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱(IEC)、凝胶排阻色谱(SEC)、亲和色谱(AFC)已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比,液相色谱复性的优点是: a) 在进样后可很快的除去变性剂; b) 由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生,提高蛋白质复性的质量和活性回收率; c) 在蛋白质复性的同时,可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的,使复性和纯化同时进行; d) 便于回收变性剂,降低废水处理成本
             4种色谱法,SEC的分离效果是LC中最差的,盐酸胍会在IEC柱上保留,与蛋白一起洗脱下来,AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵,HIC是其中较为理想的。变性蛋白在HIC上的复性机理为:当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC系统后,由于变性剂在柱子上的作用力较弱,变性蛋白质的作用力较强,变性剂首先同变性的蛋白质分离,随流动相一起流出色谱柱,又因HIC固定相能提供较常法高出十至数百倍的能量,在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的小分子,而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构,接着形成折叠中间体,随着流动相的不断变化,变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附,并在此过程中逐渐被复性,形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质,并流出色谱柱。HIC固定相是从高盐溶液中吸附变性蛋白质,且与变性剂瞬时分离,不仅大大降低了蛋白质间的聚集作用,还因固定相在分子水平上为变性蛋白提供里很高的能量,使水化的变性蛋白质瞬时失水,并形成局部结构以利于蛋白质从疏水核开始折叠。HIC在蛋白质复性的同时还能与其它杂蛋白进行很好的分离,且HIC柱便宜、快速,故有很好的发展潜力。
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